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2023-02-28 16:29:33
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逆轉衰老將成現實？最新研究：壽命成功翻一番
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王喜良
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衰老是人類疾病中最強的風險因素之一。“對抗衰老、延長壽命”是人們自古以來便追求的東西，神話裡也不乏長生不老仙丹的傳說。不過，隨著科學技術的發展，人們對衰老機制的了解越來越深入，延緩甚至逆轉衰老不再是天方夜譚。
但需要注意的是，增加壽命並不代表生活質量的提高或健康壽命的延長。例如，雖然一個生命體能活得更長，但仍會經歷與年齡相關的疾病和生理衰退。與此相反的是，年齡逆轉是指將生命體恢復到更年輕的狀態，在細胞水平上消除衰老的影響，從而增加健康壽命。所以，研究應該從這兩個角度出發。
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近日，來自美國Rejuvenate Bio公司的研究者發表了題為“Gene Therapy Mediated Partial Reprogramming Extends Lifespan and Reverses Age-Related Changes in Aged Mice”的研究論文，研究人員在衰老的小鼠中注射了攜帶有三個山中（Yamanaka）因子基因的病毒。結果顯示，這些小鼠平均活了18周，是對照組小鼠的2倍！更令人驚喜的是，小鼠體內的DNA甲基化模式有了一定程度的逆轉。
一、研究背景
衰老是一個復雜的過程，最典型的特征是——細胞過程的慢性失調，進而導致組織和器官功能惡化。現階段仍沒有預防衰老的方法，但針對這些細胞過程，可以通過幹預措施使其恢復最佳功能，從而提升壽命和健康。
現有證據表明，山中因子的重編程，能在體外和體內逆轉與年齡相關的變化。然而，山中因子（或其子集）是否能夠延長衰老野生型小鼠的壽命，仍不得而知。因此，研究人員對此進行了進一步的研究。
二、研究方法
1、載體和AAV生成
通過Genscript生成了含有四環素響應元件3（TRE3）啟動子的構建體，該啟動子從多順反子轉錄物（TRE3-OSK）驅動人OCT3/4、SOX2和KLF4的表達，同時生成了編碼hEf1a啟動子驅動的rtTA4（hEf1a-rtTA4）的第二個構建體。
通過SignaGen將構建體包裝在AAV9衣殼中生成AAV9.TRE3-OSK-SV40pA（1.556 E13 vg/ml）和AAV9-hEf1a-rtTA4-SV40pB（1.88 E12 vg/ml）。詳情如下圖所示：
研究中使用的構建體、病毒和注射途徑示意圖
（來源：Macip, C., et al. 2023）
2、小鼠研究和虛弱評分
將年齡124周的雄性C57BL6/J小鼠注射上述兩種病毒，劑量1E12 vg/只小鼠（100μl體積），通過眼眶後途徑注射。對照小鼠注射100μl配方緩沖液（PBS）。研究期間在飲用水中添加多西環素，終濃度2mg/ml，進行了“一周用/一周休”的多西環素誘導。對照小鼠在飲用水中接受與載體注射小鼠相同濃度的多西環素。
對小鼠進行單獨稱重，並依據28個不同變量進行評估，包括身體、生理和先天反射條件（包括簡單的感覺和運動測試、體溫和整體身體狀況評估）。將所有單項得分（不包括體溫和體重）相加，計算每只小鼠的脆弱指數得分（FI）。
3、組織DNA提取和甲基化研究
實驗結束時，將健康並安樂死的小鼠選入甲基化研究。按照制造商說明書，使用DNeasy血液和組織試劑盒從肝臓和心臓進行提取。隨後，對上述提取的DNA進行甲基化分析。
4、慢病毒的產生與角質形成細胞的轉導
將編碼由人EF1ɑ啟動子、PsPax2和PmD2.G驅動的多順反子OSK的質粒與PEI和Opti-MEM（Gibco）共轉染到HEK293T細胞中。第2天，用含有DMEM、15%FBS和1%PenStrep（Gibco）的收獲培養基替換培養基。在第3天和第4天收集上清液，通過0.45聚醚砜膜過濾，將1倍體積的Lenti-X濃縮液與3倍體積的澄清病毒培養基合並，並在4°C下儲存過夜。
將病毒培養基以1500 x g離心45分鍾，將顆粒重新懸浮在DMEM中。使用Lenti-X GoStix Plus對病毒進行滴度測定。將含有慢病毒的培養基滴加到HEK001（ATCC CRL-2404）傳代110中（含有8ug/ml聚胺）。在第2天加入嘌呤霉素，擴增和維持存活細胞，每3天更換一次培養基。第23天，收集細胞進行免疫印跡和甲基化分析。
5、免疫印跡分析
使用含有1mM PMSF和蛋白酶抑制劑混合物的裂解緩沖液（CST）在冰上提取上述細胞的蛋白質。將細胞裂解混合物在14,000g/4°C下旋轉10分鍾，收集上清液，並使用Pierce Rapid Gold BCA蛋白質測定試劑盒進行定量。
將等量的蛋白質裝入4-15%聚丙烯酰胺凝膠中，並轉移到PVDF膜上。將膜與一抗在4°C下孵育過夜。第二天，在室溫下將膜在與HRP偶聯的二抗中孵育1小時，並用ECL Prime Western印跡檢測試劑進行顯影。
三、研究結果
實驗結果表明，在124周齡小鼠中，編碼可誘導OSK系統的AAV遞送比野生型對照延長了109%的中位剩余壽命，並提高了幾個健康參數（如下圖）。而且，研究人員觀察到虛弱評分的顯著改善，表明實驗幹預能夠在延長壽命的同時，改善健康壽命。
圖注：左圖：注射AAV9.TRE-OSK和AAV9.hEF1ɑ-rtTA4的124周野生型小鼠的Kaplan-Meier曲線。右圖：對照小鼠和TRE-OSK小鼠在整個壽命期內的總存活比例曲線（來源：Macip, C., et al. 2023）
從死亡的對照組和TRE-OSK處理的小鼠心臓和肝臓組織中分離出DNA，發現肝臓和心臓的壽命時鍾（LUC）都有減少表觀遺傳年齡的趨勢。此外，在表達外源性OSK的人角質形成細胞中，觀察到年齡逆轉的顯著表觀遺傳標記，這表明遺傳網絡可能會被重新調節到更年輕、更健康的狀態。
綜上，該研究的小鼠和角質細胞數據表明，AAV介導的基因治療遞送OSK可提高小鼠的壽命，改善健康參數，並逆轉人類細胞衰老的生物標志物。
四、總結
再生醫學的目標是改善組織和器官功能，糾正疾病狀態。通過部分重編程實現細胞再生，已被證明是實現再生醫學目標的一條有前景的途徑。研究證明，在人類細胞中，OSK的外源性表達導致年齡逆轉。
這項研究首次證實，基於AAV的系統治療可以使極高齡野生型C57BL6/J小鼠的剩余中位壽命延長，同時也改善健康結果。這項研究的結果，對開發部分重編程幹預措施，以逆轉老年人年齡相關疾病，具有重要意義。
但目前還需要進行實驗來評估特定組織中的表觀遺傳編程特征，並對這些研究中的RNA圖譜進行全面深入的分析，以便研究哪些途徑被重編程為更年輕的狀態。
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但需要注意的是，增加壽命並不代表生活質量的提高或健康壽命的延長。例如，雖然一個生命體能活得更長，但仍會經歷與年齡相關的疾病和生理衰退。與此相反的是，年齡逆轉是指將生命體恢復到更年輕的狀態，在細胞水平上消除衰老的影響，從而增加健康壽命。所以，研究應該從這兩個角度出發。
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一、研究背景
衰老是一個復雜的過程，最典型的特征是——細胞過程的慢性失調，進而導致組織和器官功能惡化。現階段仍沒有預防衰老的方法，但針對這些細胞過程，可以通過幹預措施使其恢復最佳功能，從而提升壽命和健康。
現有證據表明，山中因子的重編程，能在體外和體內逆轉與年齡相關的變化。然而，山中因子（或其子集）是否能夠延長衰老野生型小鼠的壽命，仍不得而知。因此，研究人員對此進行了進一步的研究。
二、研究方法
1、載體和AAV生成
通過Genscript生成了含有四環素響應元件3（TRE3）啟動子的構建體，該啟動子從多順反子轉錄物（TRE3-OSK）驅動人OCT3/4、SOX2和KLF4的表達，同時生成了編碼hEf1a啟動子驅動的rtTA4（hEf1a-rtTA4）的第二個構建體。
通過SignaGen將構建體包裝在AAV9衣殼中生成AAV9.TRE3-OSK-SV40pA（1.556 E13 vg/ml）和AAV9-hEf1a-rtTA4-SV40pB（1.88 E12 vg/ml）。詳情如下圖所示：
研究中使用的構建體、病毒和注射途徑示意圖
（來源：Macip, C., et al. 2023）
2、小鼠研究和虛弱評分
將年齡124周的雄性C57BL6/J小鼠注射上述兩種病毒，劑量1E12 vg/只小鼠（100μl體積），通過眼眶後途徑注射。對照小鼠注射100μl配方緩沖液（PBS）。研究期間在飲用水中添加多西環素，終濃度2mg/ml，進行了“一周用/一周休”的多西環素誘導。對照小鼠在飲用水中接受與載體注射小鼠相同濃度的多西環素。
對小鼠進行單獨稱重，並依據28個不同變量進行評估，包括身體、生理和先天反射條件（包括簡單的感覺和運動測試、體溫和整體身體狀況評估）。將所有單項得分（不包括體溫和體重）相加，計算每只小鼠的脆弱指數得分（FI）。
3、組織DNA提取和甲基化研究
實驗結束時，將健康並安樂死的小鼠選入甲基化研究。按照制造商說明書，使用DNeasy血液和組織試劑盒從肝臓和心臓進行提取。隨後，對上述提取的DNA進行甲基化分析。
4、慢病毒的產生與角質形成細胞的轉導
將編碼由人EF1ɑ啟動子、PsPax2和PmD2.G驅動的多順反子OSK的質粒與PEI和Opti-MEM（Gibco）共轉染到HEK293T細胞中。第2天，用含有DMEM、15%FBS和1%PenStrep（Gibco）的收獲培養基替換培養基。在第3天和第4天收集上清液，通過0.45聚醚砜膜過濾，將1倍體積的Lenti-X濃縮液與3倍體積的澄清病毒培養基合並，並在4°C下儲存過夜。
將病毒培養基以1500 x g離心45分鍾，將顆粒重新懸浮在DMEM中。使用Lenti-X GoStix Plus對病毒進行滴度測定。將含有慢病毒的培養基滴加到HEK001（ATCC CRL-2404）傳代110中（含有8ug/ml聚胺）。在第2天加入嘌呤霉素，擴增和維持存活細胞，每3天更換一次培養基。第23天，收集細胞進行免疫印跡和甲基化分析。
5、免疫印跡分析
使用含有1mM PMSF和蛋白酶抑制劑混合物的裂解緩沖液（CST）在冰上提取上述細胞的蛋白質。將細胞裂解混合物在14,000g/4°C下旋轉10分鍾，收集上清液，並使用Pierce Rapid Gold BCA蛋白質測定試劑盒進行定量。
將等量的蛋白質裝入4-15%聚丙烯酰胺凝膠中，並轉移到PVDF膜上。將膜與一抗在4°C下孵育過夜。第二天，在室溫下將膜在與HRP偶聯的二抗中孵育1小時，並用ECL Prime Western印跡檢測試劑進行顯影。
三、研究結果
實驗結果表明，在124周齡小鼠中，編碼可誘導OSK系統的AAV遞送比野生型對照延長了109%的中位剩余壽命，並提高了幾個健康參數（如下圖）。而且，研究人員觀察到虛弱評分的顯著改善，表明實驗幹預能夠在延長壽命的同時，改善健康壽命。
圖注：左圖：注射AAV9.TRE-OSK和AAV9.hEF1ɑ-rtTA4的124周野生型小鼠的Kaplan-Meier曲線。右圖：對照小鼠和TRE-OSK小鼠在整個壽命期內的總存活比例曲線（來源：Macip, C., et al. 2023）
從死亡的對照組和TRE-OSK處理的小鼠心臓和肝臓組織中分離出DNA，發現肝臓和心臓的壽命時鍾（LUC）都有減少表觀遺傳年齡的趨勢。此外，在表達外源性OSK的人角質形成細胞中，觀察到年齡逆轉的顯著表觀遺傳標記，這表明遺傳網絡可能會被重新調節到更年輕、更健康的狀態。
綜上，該研究的小鼠和角質細胞數據表明，AAV介導的基因治療遞送OSK可提高小鼠的壽命，改善健康參數，並逆轉人類細胞衰老的生物標志物。
四、總結
再生醫學的目標是改善組織和器官功能，糾正疾病狀態。通過部分重編程實現細胞再生，已被證明是實現再生醫學目標的一條有前景的途徑。研究證明，在人類細胞中，OSK的外源性表達導致年齡逆轉。
這項研究首次證實，基於AAV的系統治療可以使極高齡野生型C57BL6/J小鼠的剩余中位壽命延長，同時也改善健康結果。這項研究的結果，對開發部分重編程幹預措施，以逆轉老年人年齡相關疾病，具有重要意義。
但目前還需要進行實驗來評估特定組織中的表觀遺傳編程特征，並對這些研究中的RNA圖譜進行全面深入的分析，以便研究哪些途徑被重編程為更年輕的狀態。
