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2023-02-28 16:29:33
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逆转衰老将成现实？最新研究：寿命成功翻一番
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王喜良
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衰老是人类疾病中最强的风险因素之一。“对抗衰老、延长寿命”是人们自古以来便追求的东西，神话里也不乏长生不老仙丹的传说。不过，随着科学技术的发展，人们对衰老机制的了解越来越深入，延缓甚至逆转衰老不再是天方夜谭。
但需要注意的是，增加寿命并不代表生活质量的提高或健康寿命的延长。例如，虽然一个生命体能活得更长，但仍会经历与年龄相关的疾病和生理衰退。与此相反的是，年龄逆转是指将生命体恢复到更年轻的状态，在细胞水平上消除衰老的影响，从而增加健康寿命。所以，研究应该从这两个角度出发。
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近日，来自美国Rejuvenate Bio公司的研究者发表了题为“Gene Therapy Mediated Partial Reprogramming Extends Lifespan and Reverses Age-Related Changes in Aged Mice”的研究论文，研究人员在衰老的小鼠中注射了携带有三个山中（Yamanaka）因子基因的病毒。结果显示，这些小鼠平均活了18周，是对照组小鼠的2倍！更令人惊喜的是，小鼠体内的DNA甲基化模式有了一定程度的逆转。
一、研究背景
衰老是一个复杂的过程，最典型的特征是——细胞过程的慢性失调，进而导致组织和器官功能恶化。现阶段仍没有预防衰老的方法，但针对这些细胞过程，可以通过干预措施使其恢复最佳功能，从而提升寿命和健康。
现有证据表明，山中因子的重编程，能在体外和体内逆转与年龄相关的变化。然而，山中因子（或其子集）是否能够延长衰老野生型小鼠的寿命，仍不得而知。因此，研究人员对此进行了进一步的研究。
二、研究方法
1、载体和AAV生成
通过Genscript生成了含有四环素响应元件3（TRE3）启动子的构建体，该启动子从多顺反子转录物（TRE3-OSK）驱动人OCT3/4、SOX2和KLF4的表达，同时生成了编码hEf1a启动子驱动的rtTA4（hEf1a-rtTA4）的第二个构建体。
通过SignaGen将构建体包装在AAV9衣壳中生成AAV9.TRE3-OSK-SV40pA（1.556 E13 vg/ml）和AAV9-hEf1a-rtTA4-SV40pB（1.88 E12 vg/ml）。详情如下图所示：
研究中使用的构建体、病毒和注射途径示意图
（来源：Macip, C., et al. 2023）
2、小鼠研究和虚弱评分
将年龄124周的雄性C57BL6/J小鼠注射上述两种病毒，剂量1E12 vg/只小鼠（100μl体积），通过眼眶后途径注射。对照小鼠注射100μl配方缓冲液（PBS）。研究期间在饮用水中添加多西环素，终浓度2mg/ml，进行了“一周用/一周休”的多西环素诱导。对照小鼠在饮用水中接受与载体注射小鼠相同浓度的多西环素。
对小鼠进行单独称重，并依据28个不同变量进行评估，包括身体、生理和先天反射条件（包括简单的感觉和运动测试、体温和整体身体状况评估）。将所有单项得分（不包括体温和体重）相加，计算每只小鼠的脆弱指数得分（FI）。
3、组织DNA提取和甲基化研究
实验结束时，将健康并安乐死的小鼠选入甲基化研究。按照制造商说明书，使用DNeasy血液和组织试剂盒从肝脏和心脏进行提取。随后，对上述提取的DNA进行甲基化分析。
4、慢病毒的产生与角质形成细胞的转导
将编码由人EF1ɑ启动子、PsPax2和PmD2.G驱动的多顺反子OSK的质粒与PEI和Opti-MEM（Gibco）共转染到HEK293T细胞中。第2天，用含有DMEM、15%FBS和1%PenStrep（Gibco）的收获培养基替换培养基。在第3天和第4天收集上清液，通过0.45聚醚砜膜过滤，将1倍体积的Lenti-X浓缩液与3倍体积的澄清病毒培养基合并，并在4°C下储存过夜。
将病毒培养基以1500 x g离心45分钟，将颗粒重新悬浮在DMEM中。使用Lenti-X GoStix Plus对病毒进行滴度测定。将含有慢病毒的培养基滴加到HEK001（ATCC CRL-2404）传代110中（含有8ug/ml聚胺）。在第2天加入嘌呤霉素，扩增和维持存活细胞，每3天更换一次培养基。第23天，收集细胞进行免疫印迹和甲基化分析。
5、免疫印迹分析
使用含有1mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液（CST）在冰上提取上述细胞的蛋白质。将细胞裂解混合物在14,000g/4°C下旋转10分钟，收集上清液，并使用Pierce Rapid Gold BCA蛋白质测定试剂盒进行定量。
将等量的蛋白质装入4-15%聚丙烯酰胺凝胶中，并转移到PVDF膜上。将膜与一抗在4°C下孵育过夜。第二天，在室温下将膜在与HRP偶联的二抗中孵育1小时，并用ECL Prime Western印迹检测试剂进行显影。
三、研究结果
实验结果表明，在124周龄小鼠中，编码可诱导OSK系统的AAV递送比野生型对照延长了109%的中位剩余寿命，并提高了几个健康参数（如下图）。而且，研究人员观察到虚弱评分的显著改善，表明实验干预能够在延长寿命的同时，改善健康寿命。
图注：左图：注射AAV9.TRE-OSK和AAV9.hEF1ɑ-rtTA4的124周野生型小鼠的Kaplan-Meier曲线。右图：对照小鼠和TRE-OSK小鼠在整个寿命期内的总存活比例曲线（来源：Macip, C., et al. 2023）
从死亡的对照组和TRE-OSK处理的小鼠心脏和肝脏组织中分离出DNA，发现肝脏和心脏的寿命时钟（LUC）都有减少表观遗传年龄的趋势。此外，在表达外源性OSK的人角质形成细胞中，观察到年龄逆转的显著表观遗传标记，这表明遗传网络可能会被重新调节到更年轻、更健康的状态。
综上，该研究的小鼠和角质细胞数据表明，AAV介导的基因治疗递送OSK可提高小鼠的寿命，改善健康参数，并逆转人类细胞衰老的生物标志物。
四、总结
再生医学的目标是改善组织和器官功能，纠正疾病状态。通过部分重编程实现细胞再生，已被证明是实现再生医学目标的一条有前景的途径。研究证明，在人类细胞中，OSK的外源性表达导致年龄逆转。
这项研究首次证实，基于AAV的系统治疗可以使极高龄野生型C57BL6/J小鼠的剩余中位寿命延长，同时也改善健康结果。这项研究的结果，对开发部分重编程干预措施，以逆转老年人年龄相关疾病，具有重要意义。
但目前还需要进行实验来评估特定组织中的表观遗传编程特征，并对这些研究中的RNA图谱进行全面深入的分析，以便研究哪些途径被重编程为更年轻的状态。
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但需要注意的是，增加寿命并不代表生活质量的提高或健康寿命的延长。例如，虽然一个生命体能活得更长，但仍会经历与年龄相关的疾病和生理衰退。与此相反的是，年龄逆转是指将生命体恢复到更年轻的状态，在细胞水平上消除衰老的影响，从而增加健康寿命。所以，研究应该从这两个角度出发。
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一、研究背景
衰老是一个复杂的过程，最典型的特征是——细胞过程的慢性失调，进而导致组织和器官功能恶化。现阶段仍没有预防衰老的方法，但针对这些细胞过程，可以通过干预措施使其恢复最佳功能，从而提升寿命和健康。
现有证据表明，山中因子的重编程，能在体外和体内逆转与年龄相关的变化。然而，山中因子（或其子集）是否能够延长衰老野生型小鼠的寿命，仍不得而知。因此，研究人员对此进行了进一步的研究。
二、研究方法
1、载体和AAV生成
通过Genscript生成了含有四环素响应元件3（TRE3）启动子的构建体，该启动子从多顺反子转录物（TRE3-OSK）驱动人OCT3/4、SOX2和KLF4的表达，同时生成了编码hEf1a启动子驱动的rtTA4（hEf1a-rtTA4）的第二个构建体。
通过SignaGen将构建体包装在AAV9衣壳中生成AAV9.TRE3-OSK-SV40pA（1.556 E13 vg/ml）和AAV9-hEf1a-rtTA4-SV40pB（1.88 E12 vg/ml）。详情如下图所示：
研究中使用的构建体、病毒和注射途径示意图
（来源：Macip, C., et al. 2023）
2、小鼠研究和虚弱评分
将年龄124周的雄性C57BL6/J小鼠注射上述两种病毒，剂量1E12 vg/只小鼠（100μl体积），通过眼眶后途径注射。对照小鼠注射100μl配方缓冲液（PBS）。研究期间在饮用水中添加多西环素，终浓度2mg/ml，进行了“一周用/一周休”的多西环素诱导。对照小鼠在饮用水中接受与载体注射小鼠相同浓度的多西环素。
对小鼠进行单独称重，并依据28个不同变量进行评估，包括身体、生理和先天反射条件（包括简单的感觉和运动测试、体温和整体身体状况评估）。将所有单项得分（不包括体温和体重）相加，计算每只小鼠的脆弱指数得分（FI）。
3、组织DNA提取和甲基化研究
实验结束时，将健康并安乐死的小鼠选入甲基化研究。按照制造商说明书，使用DNeasy血液和组织试剂盒从肝脏和心脏进行提取。随后，对上述提取的DNA进行甲基化分析。
4、慢病毒的产生与角质形成细胞的转导
将编码由人EF1ɑ启动子、PsPax2和PmD2.G驱动的多顺反子OSK的质粒与PEI和Opti-MEM（Gibco）共转染到HEK293T细胞中。第2天，用含有DMEM、15%FBS和1%PenStrep（Gibco）的收获培养基替换培养基。在第3天和第4天收集上清液，通过0.45聚醚砜膜过滤，将1倍体积的Lenti-X浓缩液与3倍体积的澄清病毒培养基合并，并在4°C下储存过夜。
将病毒培养基以1500 x g离心45分钟，将颗粒重新悬浮在DMEM中。使用Lenti-X GoStix Plus对病毒进行滴度测定。将含有慢病毒的培养基滴加到HEK001（ATCC CRL-2404）传代110中（含有8ug/ml聚胺）。在第2天加入嘌呤霉素，扩增和维持存活细胞，每3天更换一次培养基。第23天，收集细胞进行免疫印迹和甲基化分析。
5、免疫印迹分析
使用含有1mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液（CST）在冰上提取上述细胞的蛋白质。将细胞裂解混合物在14,000g/4°C下旋转10分钟，收集上清液，并使用Pierce Rapid Gold BCA蛋白质测定试剂盒进行定量。
将等量的蛋白质装入4-15%聚丙烯酰胺凝胶中，并转移到PVDF膜上。将膜与一抗在4°C下孵育过夜。第二天，在室温下将膜在与HRP偶联的二抗中孵育1小时，并用ECL Prime Western印迹检测试剂进行显影。
三、研究结果
实验结果表明，在124周龄小鼠中，编码可诱导OSK系统的AAV递送比野生型对照延长了109%的中位剩余寿命，并提高了几个健康参数（如下图）。而且，研究人员观察到虚弱评分的显著改善，表明实验干预能够在延长寿命的同时，改善健康寿命。
图注：左图：注射AAV9.TRE-OSK和AAV9.hEF1ɑ-rtTA4的124周野生型小鼠的Kaplan-Meier曲线。右图：对照小鼠和TRE-OSK小鼠在整个寿命期内的总存活比例曲线（来源：Macip, C., et al. 2023）
从死亡的对照组和TRE-OSK处理的小鼠心脏和肝脏组织中分离出DNA，发现肝脏和心脏的寿命时钟（LUC）都有减少表观遗传年龄的趋势。此外，在表达外源性OSK的人角质形成细胞中，观察到年龄逆转的显著表观遗传标记，这表明遗传网络可能会被重新调节到更年轻、更健康的状态。
综上，该研究的小鼠和角质细胞数据表明，AAV介导的基因治疗递送OSK可提高小鼠的寿命，改善健康参数，并逆转人类细胞衰老的生物标志物。
四、总结
再生医学的目标是改善组织和器官功能，纠正疾病状态。通过部分重编程实现细胞再生，已被证明是实现再生医学目标的一条有前景的途径。研究证明，在人类细胞中，OSK的外源性表达导致年龄逆转。
这项研究首次证实，基于AAV的系统治疗可以使极高龄野生型C57BL6/J小鼠的剩余中位寿命延长，同时也改善健康结果。这项研究的结果，对开发部分重编程干预措施，以逆转老年人年龄相关疾病，具有重要意义。
但目前还需要进行实验来评估特定组织中的表观遗传编程特征，并对这些研究中的RNA图谱进行全面深入的分析，以便研究哪些途径被重编程为更年轻的状态。
